Expresión heteróloga de la proteína OmpU de Vibrio cholerae y su purificación por cromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados

Número: 
Autores/Authors: 
Alina Falero, Edith Suzarte, Belinda Águila, Javier Campos, Rafael Fando.
Palabras Claves / Key words: 
cromatografía de afinidad, Vibrio cholerae, OmpU, purificación, affinity chromatography, Vibrio cholerae, OmpU, purification.
Resumen: 
OmpU es una proteína integral de membrana de la familia de las porinas que se ubica en la envoltura externa de las bacterias del género Vibrio. Este manuscrito describe la obtención de un plásmido recombinante para expresar la proteína OmpU fusionada a un dominio c-terminal myc-hexahistidina (myc-hexa-his) de 2 kDa. La proteína recombinante resultante OmpU-myc-hexa-his codificada en el plásmido se expresa en la cepa Escherichia coli Top 10, acumulándose en forma insoluble en el interior celular. La recuperación de la proteína a partir de los cuerpos de inclusión insolubles se realiza en urea 7 mol/L. La forma desnaturalizada se purificó por cromatografía de afinidad a iones metálicos inmovilizados. El análisis por SDS-PAGE de las fracciones purificadas detectó una proteína de aproximadamente 40 kDa, en correspondencia con la masa molecular reportada para el monómero natural de OmpU (38 kDa) en Vibrio cholerae y el dominio c-terminal acoplado. La proteína recombinante obtenida reaccionó en inmunoblot con los anticuerpos monoclonales anti-OmpU y anti-hexa-his. La detección de la misma banda con estos dos anticuerpos indica la coexistencia de la proteína OmpU y el epitopo hexa-histidina en una misma especie. En las condiciones de estudio empleadas, la proteína se obtuvo en un solo paso cromatográfico, resultado del cual el grado de pureza se incrementó hasta el 90 %; con un rendimiento del 23 %. Se dispone ahora del sistema vector hospedero necesario para expresar la proteína.
Abstract: 
OmpU is an integral outer membrane protein belonging to the porine family, which is present in the outer membrane of bacteria of the genus Vibrio. This manuscript describes the construction of a recombinant plasmid coding for OmpU protein fused to a myc-hexa-histidine domain (myc-hexa-his) of 2 kDa. The plasmid encoded recombinant protein OmpU-myc-hexa-his, is expressed at high levels in the E. coli Top 10 strain, which is accumulated insoluble in inclusion bodies inside the cell. The recombinant protein is recovered in 7 mol/L urea from insoluble inclusion bodies. The denatured form was purified by immobilized metal-chelate affinity chromatography. SDS-PAGE analysis of the purified fractions detected a band of approximately 40 kDa, which is in correspondence with the molecular mass reported for the wild type monomer of OmpU (38 kDa) in Vibrio cholerae strains coupled to the recombinant c-myc-hexa-his domain. The recombinant protein reacted with anti-OmpU y anti-hexa-his monoclonal antibodies in western blotting. The detection of comigrating bands with these two antibodies indicates the presence of OmpU protein fused to hexa-hystidine tag in the same peptide. The protocol described allowed obtaining this protein in a single chromatographic step and increased the purity up to 90 %, yielding on average a 23 % of the initial amount. Consequently, a host -vector system is available to express this protein.
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