Vector de clonación para la transferencia conjugativa de ADN de E. coli a. Streptomyces spp .

Número: 
Autores/Authors: 
Grisel Rosabal, Ricardo, del Sol, Caridad Rodriguez, Elsa Pimienta, Karen Marre Gonzílez, Ileana Otero, Alfredo Figarola y Carlos Víllin
Palabras Claves / Key words: 
conjugación, donación, vector bifuncional, Streptomyces, conjugation, cloning, shuttle vector
Resumen: 
A partir del vector bifuncional y multicopia pUWL-218 se construyó un vector de clonación pRET 1, para la transferencia conjugativa de ADN de E. col• a.Streptomyces spp . Este vector contiene el fragmento oriT de 760 pb, proveniente del plasmidio RK2 (INcP), el cual permite la conjugación. Ademís de ser bifuncional y conjugativo-replicativo, este vector presenta ventajas tales como: amplio espectro de hospederos en Streptomy ces, multicopia con replicación autónoma, gen marcador tsr confiriendo' resistencia a tioestreptona en Streptomyces, gen marcador bla confiriendo resistencia a ampicillina en E . col•, posee múltiples sitios de clonación, permite secuenciación directa de fragmentos deADN y su expresión heteróloga . Su efectividad y funcionalidad fue comprobada con la clonación de un frag mento activador pleiotrópico aislado en el laboratorio. Se obtuvo el plasmidio recombinante conjugativo-replicativo pRKT 1, el cual permite obtener en un breve.plazo y con gran eficiencia conjugantes de varias especies de Strep- . tomyces : S. fradiae, S . ambofaciens y S. rimosus . Estas son cepas productoras de antibióticos poliquétidos de interés comercial, pero al trabajarlas :genéticamente presentan una dificultad notoria para formar y transformar protoplastos, procesos que ocurren con muy baja eficiencia . Se obtuvieron con ambos plasmidios, construidos porcentajes elevados de conjugantes y ademís, cepas recombinantes de Streptomyces genéticamente mís estables que las obtenidas por el procedimiento convencionalmente utilizado, quedando demostrado las ventajas de la conjugación sobre la transformación en este género
Abstract: 
A cloning vector pRET1, for the conjugal transfer of DNA from E: coli to Streptomyres spp., was built starting from the multicopy shuttle vector pUWL-218. This vector contains the '760 by oriT fragment from the INcP piasmid RK2, which allows the conjugation . Besides being conjugal and bifurictional, this vector has advantages .: like : wide-host-range inμStrep- . tomyces, vector multicopy with autonomous replication marker tsr gene conferring resistance to thioestrepton in . Streptornyces, -marker bla ,gene-, co iferring'resistance to ampicillin in E . coli, it possesses multiple cloning of unique restriction sites,' it allows directsequencing of fragments of DNA and expression ;of heterologous proteins. The effectiveness of this vector was proven with the cloning of a pleiotrOEpic activator fragment isolated in the laboratory. The conjugal, recombinantplasmid pRKT 1 was obtained, which allowed to obtain in a brief term and with high efficiency conjugants of several species of Streptomyces S.fradiae, S. ambof,aciens.and S. rimósus. These three strains produce poliketide antibiotics b27 commercial attractive, but it is very difficult working genetically because it is not aneasy form and transform, protoplasts with them . Both processes take a place with low effectiveness. High per cent of cónjugants with both plasmids and recombinants strains of Streptomyces genetically more stable were obtained in this work
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