Instrumentos para dispensado y lectura de microarreglos: robot cartesiano y lector de cromatografía de capa delgada

Número: 
Autores/Authors: 
Miguel Ángel García Álvarez, Abel Toledano Hernández, Armando Torras Fernández de Coca, Jorge Gentile Martínez Casado, Omar Pico García, Félix Pico García, Serguey Hernández Pereira, Evislandy Herrera Vélez, Alexis Marrero Rodríguez, Milenen María Hernández Marín, María Elena Selles León, José Luis Fernández Yero, Dennys González Aguilera, René Robaina Álvarez
Palabras Claves / Key words: 
microarreglos, multiensayo, robot cartesiano, lector de CCD, microarrays, multi-assay, cartesian robot, CCD reader
Resumen: 

Un microarreglo consiste en cientos o miles de microgotas de diferentes reactivos con volúmenes de nanolitros, depositadas como una matriz sobre un soporte plano. Esta técnica desempeña un papel fundamental dentro del multianálisis. El objetivo del trabajo fue el desarrollo de dos instrumentos para la construcción y análisis de microarreglos: un robot dispensador y un lector de Cromatografía de capa delgada (CCD). El robot posee movimiento tridimensional XYZ. Emplea actuadores lineales y servomotores sin escobillas con codificador interno, lo que permite obtener una resolución de 1 µm en el plano XY, y un breve tiempo de dispensado debido a la gran velocidad de los servomotores. Emplea dispensadores por contacto y no contacto. Posee estaciones para la carga de reactivos, limpieza y comprobación de los dispensadores. El lector es una cámara de CCD de 490 píxeles x 490 píxeles, enfriada por un elemento Peltier para disminuir el ruido térmico. La luz excitadora se canaliza por un haz de fibras ópticas e incide sobre el microarreglo y la fluorescencia emitida es captada por el CCD. El soporte plano es una placa de poliestireno con capacidad para 96 microarreglos de hasta 100 puntos y área de 6 mm2 x 6 mm2 cada uno. Cada equipo se controla por una computadora personal que permite la programación de la secuencia de trabajo según un protocolo flexible. Estos instrumentos son los primeros de su tipo construidos en Cuba. Permiten el dispensado y la lectura de microarreglos fluorescentes de gran densidad, con elevada precisión y repetibilidad. Actualmente, se emplean en la construcción y procesamiento de microarreglos de proteínas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Abstract: 

Microarrays consist of hundreds or thousands of microdrops of different reagents with nanoliter volume, deposited like a matrix on a flat support. This technique plays a fundamental role in multi-analysis. The goal was to develop instruments for microarray building and analysis: a Microarray Dispenser Robot (MDR) and a CCD reader. The robot has XYZ tridimensional movement. It uses linear actuators and brushless servomotors with internal encoders, which allow obtaining a resolution of 1 µm in the XY plane and the reduction in the dispensing time due to the servomotors high speed. In addition, it uses contact and non-contact dispensers. It has stations for reagents loading, cleaning and assessment of dispensers. The reader is a CCD camera of 490 pixels x 490 pixels, cooled by a Peltier element to reduce thermal noise. The exciting light is channelized by means of an optical fiber assemblies falling on the microarray, then the emitted fluorescence is captured by the CCD. The flat support consists of a polystyrene plate with 96 microarrays of up to 100 dots and 6 mm2 x 6 mm2 area each. Each equipment is controlled by a PC, which allows programming the work sequence according to a flexible protocol. These instruments are the first of their kind built in Cuba. They permit the dispensation and reading of high density fluorescent microarrays with great precision and repeatability. At present, they are used to build up proteins microarrays for the diagnosis of infectious diseases.

Texto Completo: 

INTRODUCCIÓN

La tecnología de los microarreglos de DNA surgió inicialmente como un método experimental para el estudio del genoma de un organismo, pero pronto se extendió a los microarreglos de proteínas, carbohidratos, células y tejidos. Constituye uno de los últimos avances en la biología molecular que permite la monitorización de la expresión de decenas de miles de genes en paralelo.1,2

Un microarreglo es comúnmente definido como una colección de gotas microscópicas organizadas en forma de cuadrícula o rejilla y adheridas a una superficie sólida o membrana.3 Los primeros ensayos de afinidad con muestras fijas sobre soportes sólidos se realizaron con ensayos inmunológicos, inmovilizando sobre una superficie, antígenos o anticuerpos para su detección.

El elevado grado de integración del arreglo permite, en un solo ensayo, obtener multitud de valores de expresión génica relativa para distintas condiciones biológicas, lo que convierte a esta técnica en una herramienta de gran rendimiento para trabajos en el área de la genómica funcional.4

Esta tecnología permite diagnosticar varias enfermedades simultáneamente y realizar un monitoreo de los estadios de las enfermedades. Esto trae consigo un mayor ahorro de tiempo, reactivos empleados y costo, y la posibilidad de aplicar terapias más específicas en el momento de tratar una enfermedad. Por otro lado, el equipamiento es en extremo costoso (un equipo pequeño para dispensar puede costar alrededor de $60 000).

Actualmente, son muchas las aplicaciones en ramas como el diagnóstico clínico y molecular, descubrimiento y desarrollo de fármacos, identificación de dianas terapéuticas, farmacogenética e investigación básica.4-6En estos tiempos los microarreglos constituyen una herramienta imprescindible en cualquier proyecto de genómica o proteómica.7

En las técnicas ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay) actuales, cada placa viene preparada para una determinación específica, mientras que los puntos de los microarreglos se dispensan de forma matricial en el espacio que antes ocupaba una sola determinación, por lo que ahora se pueden hacer múltiples determinaciones a una misma muestra del paciente, puesto que las placas vendrán listas para este fin. Esto tiene un gran impacto en los pesquisajes masivos.

Debido al elevado costo del equipamiento que permite implementar esta tecnología, el objetivo trazado fue diseñar, construir y poner a puntoequipos para el dispensado y lectura de microarreglos fluorescentes: un robot cartesiano con movimiento XYZ, capaz de dispensar nanolitros de reactivos sobre la superficie de un sustrato dispuesto sobre un soporte plano (placa de poliestireno) y un lector de fluorescencia basado en una cámara de CCD.

MATERIALES Y MÉTODOS

Robot cartesiano con movimiento en los ejes XYZ

Sus dimensiones externas son de 2000 mm de largo, 1060 mm de ancho y 1700 mm de altura y su función es mover de forma controlada un cabezal con dispensadores de nanolitros. En el plano XY el movimiento se realiza por medio de servomotores de CD sin escobillas y actuadores lineales con tornillos de bolas y paso de rosca de 5 mm;  en el eje Z se dispone de un actuador lineal de paso de rosca de 2 mm, movido por un motor de pasos de 0,9°/paso.

Todo el sistema de movimiento se coloca sobre una placa de mármol soportada por una estructura de tubos de acero dotada de calzos antivibratorios y soportes neumáticos, y se protege contra el polvo por una cubierta de perfiles de acero y planchas de plástico transparente. El peso total del equipo es de 600 kg, lo que le confiere la necesaria inercia y estabilidad para soportar las bruscas aceleraciones que se producen en los elementos móviles durante el trabajo (Fig. 1 y Tabla 1). Las especificaciones de cada eje se muestran a continuación.

Fig. 1. Robot XYZ.

Tabla 1. Especificaciones de cada eje del robot

El robot admite hasta cuatro dispensadores, que pueden ser pines, dispensadores piezoeléctricos o capilares de cuarzo (construidos en el propio Centro de Inmunoensayo), colocados en el eje Z.8 Posee estaciones para la carga de los reactivos, que se colocan en los pocillos de placas de 96 posiciones y estaciones para el lavado y secado de los dispensadores con líquido de lavado y vacío respectivamente. Las operaciones de carga de reactivos, lavado y secado se realizan por medio de bombas de jeringa y válvulas en Y programables. También dispone de un área para el dispensado de prueba y acondicionamiento y el área de dispensado de microarreglos.

Todas las operaciones del robot se controlan por medio de una computadora personal industrial, dotada de una interfaz gráfica que corre sobre un Sistema Operativo personalizado basado en Microsoft Windows® y desarrollada con Delphi® Pascal. El software permite controlar:

  • El movimiento de los ejes XYZ.
  • El accionamiento de cuatro bombas de jeringa para la carga de reactivos y el lavado de los dispensadores.
  • El control de la bomba de vacío para el secado de los dispensadores.
  • El control de los dispensadores piezoeléctricos (número y volumen de las nanogotas).
  • La interfaz gráfica brinda opciones que permiten al operador programar protocolos flexibles en los que se puede establecer:
    • El número de microarreglos a dispensar, la cantidad de puntos del microarreglo y la distancia entre puntos, en los ejes X e Y.
    • Número de ciclos de lavado, volumen de lavado y tiempo de secado.
    • Número de reactivos y volumen a cargar.
  • La ejecución de un protocolo típico que consta de los pasos siguientes:
    • Posicionamiento del cabezal con los dispensadores sobre la estación de carga de reactivos y carga del volumen de reactivo programado con las bombas de jeringa.
    • Colocación del cabezal sobre la estación de secado y secado de las puntas con vacío, para eliminar el reactivo sobrante.
    • Realización de un dispensado de control en el área de prueba y después comienzo del dispensado de los microarreglos en el área de dispensado (600 mm x 500 mm).
    • Colocación del cabezal sobre la estación de lavado y lavado de los dispensadores absorbiendo y expeliendo líquido de lavado con las bombas de jeringa.
    • Por último secado de los dispensadores para dejarlos listos para iniciar otro ciclo de dispensado con nuevos reactivos.

Lector de CCD

Cuenta principalmente con una mesa provista de movimiento controlado en el plano horizontal XY, sobre la cual se coloca el soporte con los microarreglos, y una cámara de CCD fija sobre la mesa XY y enfocada hacia la superficie de la mesa.
Las dimensiones del lector son 430 mm x 340 mm x 270 mm. En la parte frontal del equipo se encuentra una abertura por donde sale y entra el soporte de los microarreglos (Fig. 2).

Fig. 2. Lector de CCD.

El movimiento de la mesa en el plano XY se realiza mediante motores de paso con una resolución de 150 µm/paso. El CCD de la cámara posee 490 x 490 = 240,100 píxeles, y cada píxel capta un área de 12 µm2 x 12 µm2 en el objeto. El área del campo de visión es de 6 mm2 x 6 mm2. Debido a que la fluorescencia emitida por los puntos es muy débil, los tiempos de integración pueden ser de hasta 2 a 3 s. Por esa razón, es necesario enfriar el CCD con un elemento Peltier, para disminuir el ruido térmico provocado por la corriente oscura en el CCD.9,10

El lector posee un microcontrolador interno que recibe comandos de una computadora personal externa por medio del puerto USB. A partir de los comandos recibidos desde ella el microcontrolador ejecuta de forma autónoma las funciones siguientes:

  • Movimiento de los motores de paso de la mesa para ubicar el microarreglo seleccionado en el plano imagen de la cámara de CCD.
  • Control de los relojes del CCD para obtener la señal de video correspondiente a la imagen de la fluorescencia del microarreglo.
  • Control del proceso de amplificación de la señal de video y su posterior conversión en señal digital.
  • Transmición de la información de video digitalizada hacia la computadora personal.

En el diagrama del sistema óptico, la fuente de luz excitadora es una lámpara de halógeno con reflector elíptico (Fig. 3). La luz emitida pasa por un filtro térmico (2) y por el filtro primario de fluorescencia (4). La radiación útil incide en el haz de fibras ópticas (5) y se bifurca en dos haces para lograr la iluminación uniforme de la muestra (7). La luz fluorescente emitida por los puntos del microarreglo pasa por el filtro secundario de fluorescencia (8), es captada por la lente objetivo (9) e incide finalmente en el detector CCD (10).

El soporte de los microarreglos consiste de una placa de poliestireno con el formato Micro ELISA de 96 pocillos, donde cada pocillo tiene un área de 6 mm2 x 6 mm2 y puede soportar un microarreglo de hasta 10 x 10 = 100 puntos.11 No obstante, la programación del movimiento es flexible y se puede colocar otro tipo de soporte con un área máxima de 86 mm2 x 128 mm2.

El software de la computadora personal permite capturar y visualizar la imagen del microarreglo fluorescente, así como realizar un procesamiento primario que incluye segmentación, separación de los puntos fluorescentes del fondo, medición del área de los puntos, su fluorescencia total, así como otras opciones.12,13

Fig. 3. Sistema óptico.

 

En el proceso de ajuste y puesta a punto de ambos equipos, se realizaron experimentos para optimizar el dispensado y lectura de microarreglos. Como marcador fluorescente se empleó el fluorógeno CY3 (Excitación-Emisión: 546 - 578 nm).14 Se dispensaron microarreglos con dispensadores capilares y piezoeléctricos, y se estudió la acción de distintas sustancias tales como glicerina y surfactantes sobre la forma de los puntos dispensados. La adición de estas sustancias a la disolución persigue el objetivo de optimizar su viscosidad, así como su tensión superficial para lograr la mejor morfología y homogeneidad de los puntos dispensados.

 

Entre los factores que pueden influir en el análisis de la imagen y los datos del microarreglo se encuentran los que pueden ocurrir durante los procesos de fabricación, marcaje o hibridación, otros factores pueden ser las irregularidades en el tamaño, forma y posición del dispensado. Un tratamiento inadecuado de estos errores conduce a conclusiones biológicas erróneas.15


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como resultado de los experimentos, se observó que la adición de glicerina del 5 al - 15 % en la disolución de fluorógeno mejora apreciablemente la morfología y uniformidad de los puntos dispensados, tanto con capilares como con piezoeléctricos. Además, los capilares demostraron ser más confiables en el dispensado que los piezoeléctricos, y los pocos puntos fallidos observados se debieron siempre a la presencia de partículas de polvo o irregularidades en la superficie del soporte. El diámetro de los puntos obtenidos estuvo en el intervalo de 150 a 250 µm. (Fig. 4) Imágenes de cuatro microarreglos de 7 x 7 puntos cada uno dispensados con capilares.

 

 

Fig. 4. Imágenes correspondientes a cuatro microarreglos de 7 x 7 puntos cada uno dispensado con capilares.

Se muestra el valor del área (en píxeles) de todos los puntos de cuatro microarreglos (E1-F1-G1-H1) de 7 x 7 puntos cada uno (49 en cada microarreglo), dispensado con el mismo capilar.
Se observó en general una buena uniformidad de los puntos, aunque se manifestó una ligera tendencia a la disminución del área del punto con el progreso del dispensado (Fig. 5).

Fig. 5. Área (en píxeles) de los puntos correspondientes a cuatro microarreglos.

Se muestran los valores medios del área, fluorescencia total y diámetro de todos los puntos de los microarreglos E1-H1 (Fig. 6). El coeficiente de variación de la fluorescencia total media para ocho microarreglos fue de 9,22 %.

La velocidad del robot es tal que permite el dispensado de 4800 microarreglos de 64 (8 x 8) puntos en una jornada laboral de 8 h, incluidos los tiempos de preparación del robot y de los reactivos, así como de la colocación y retiro de los soportes.

En cuanto al lector, se observó que es capaz de leer una placa con 96 microarreglos en un tiempo del orden de los 5 min, en que el de integración para la captura de la señal fluorescente es del orden de los 500 ms por microarreglo, y el de trasmisión de una imagen a la computadora personal es de 1,5 s.

Fig. 6. Valores medios del área, fluorescencia total y diámetro de los puntos.

Como prueba de aplicación práctica, se diseñó, construyó y evaluó un microarreglo de 30 puntos con proteínas recombinantes y péptidos sintéticos, que forman un multiensayo para la detección de varias enfermedades infecciosas.

La reactividad de los péptidos sintéticos y las proteínas recombinantes fue analizada empleando muestras de suero que contenían anticuerpos específicos a los virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y 2 (VIH-1/2)  y al linfotrópico de las células t humanas (HTLV-I/II), las cuales fueron confirmadas y caracterizadas por Western Blot (WB). Además, se evaluaron muestras positivas al virus de la hepatitis C (HCV), confirmadas a partir de un ensayo LIA (Line Immunoassay) y muestras reactivas al trypanosoma cruzi, procedentes de regiones endémicas de este parásito. Para evaluar la especificidad de estas proteínas se utilizaron muestras negativas de donantes de sangre sanos.

Se estudiaron muestras positivas a los virus VIH-1, al VIH-2, al HTLV-II, al HCV y al trypanosoma cruzi, así como una muestra negativa en una matriz de proteínas (Fig. 7). Se observaron cinco puntos fluorescentes correspondientes a la reactividad de los anticuerpos específicos presentes en la muestra positiva al VIH-1 frente a una proteína recombinante p24, un péptido sintético gp41, una proteína recombinante gp41, un péptido quimérico representativo de las regiones de envoltura gp120 y transmembrana gp41 y también a un péptido sintético gp120 (Fig. 7 A). Estos resultados se correspondieron con los obtenidos en el ensayo de WB para la confirmación y caracterización de esta muestra donde fueron visualizadas las bandas correspondientes a las proteínas p24, gp41 y gp120 del VIH-1.

Se comprobó el reconocimiento del péptido gp36 perteneciente a la proteína de transmembrana del VIH-2 frente a una muestra VIH-2 positiva (Fig. 7 B). Frente a una muestra HTLV-II positiva se observaron dos puntos fluorescentes, uno correspondiente a un péptido de la proteína del núcleo p19 y otro a un péptido de la proteína de envoltura gp46 del HTLV-II (Fig. 7 C). Estos resultados también se correspondieron con los obtenidos en el ensayo de WB.

Se observaon dos puntos fluorescentes obtenidos a partir de la reacción de los anticuerpos presentes en una muestra HCV positiva, uno de los puntos pertenecía a un péptido de la región del núcleo y el otro, a un péptido quimérico de las regiones no estructurales NS4 y NS5 (Fig. 7 D). Los resultados anteriores se correspondieron con los obtenidos en un ensayo confirmatorio LIA.

Además los resultados en el multiensayo para una muestra que presentaba anticuerpos específicos contra el trypanosoma cruzi, se observaron dos puntos fluorescentes correspondientes a dos péptidos sintéticos, los que pertenecían a diferentes secuencias repetitivas del parásito (Fig. 7 E).

Los resultados en el microarreglo de proteínas para el multidiagnóstico fueron comparados con los resultados correspondientes a ensayos UMELISA HIV1+2 Recombinant, UMELISA HCV, UMELISA HTLV y UMELISA Chagas (Tecnosuma Internacional SA) de tipo indirecto para la detección de anticuerpos contra cada uno de los agentes infecciosos de forma independiente y en todos los casos hubo correspondencia entre los resultados del microarreglo y los ensayos comerciales.

Se probaron además, muestras negativas de banco de sangre para el estudio de especificidad. Se observó el resultado del multiensayo de una de las muestras negativas estudiadas, en este caso no se evidenció reactividad para ninguno de los antígenos presentes en la fase sólida (Fig. 7 F).

Fig. 7. Reactividad de las proteínas recombinantes y los péptidos sintéticos que estaban presentes en el microarreglo frente a muestras positivas de diferentes agentes infecciosos y una muestra de donante de sangre sano. (A) Muestra positiva al VIH-1. (B) Muestra positiva al VIH-2. (C) Muestra positiva al HTLV-II. (D) Muestra positiva al HCV. (E) Muestra positiva al trypanosoma cruzi. (F) Muestra negativa de donante de sangre sano.

Los resultados anteriores demuestran las potencialidades y ventajas de este método de diagnóstico.16,17

Los robots dispensadores son equipos en extremo costosos en el mercado, sobre todo, los destinados a producciones en serie. El robot construido está concebido para la producción a gran escala de microarreglos para el diagnóstico, por lo que no se requiere la fabricación de muchos equipos (con dos o tres se puede disponer de una planta de producción); mientras que el lector no posee un costo elevado y es factible su instalación en los laboratorios para la realización de los análisis a pacientes o para pesquisaje.

El trabajo conjunto de ambos equipos muestra la posibilidad de la construcción y lectura de microarreglos para aplicaciones prácticas tales como el diagnóstico de enfermedades infecciosas. No obstante, quedan todavía limitantes y aspectos que perfeccionar. Si en el caso de los microarreglos de DNA todas las moléculas participantes tienen prácticamente las mismas dimensiones y propiedades, en el caso de los microarreglos de proteínas, la situación es diferente. Distintas proteínas pueden tener grandes diferencias entre sus propiedades y pesos moleculares, lo que hace necesario ajustar la dilución y composición de las respectivas disoluciones de proteínas para que los puntos del microarreglo tengan similar morfología y volumen.

Otro aspecto importante es la uniformidad del dispensado. Al desplazarse el cabezal por el área de dispensado se modifica la forma y posición de los tubos que conectan a los dispensadores con las bombas de jeringa, lo cual puede influir sobre los nanovolúmenes dispensados.

Actualmente, se trabaja en el mejoramiento de la velocidad de dispensado, particularmente en el eje Z, y es necesario mejorar la limpieza del ambiente en el área productiva para evitar la contaminación de los microarreglos. También se trabaja en la optimización de los reactivos para mejorar el nivel de la señal fluorescente obtenida, así como en el software de procesamiento, análisis y presentación de los resultados de la lectura de los microarreglos.

CONCLUSIONES

Se construyeron dos equipos que constituyen un satisfactorio primer intento para desarrollar en Cuba instrumentos para la construcción de microarreglos, los cuales logran una elevada productividad y calidad, de manera que pueden ser empleados en el Sistema Nacional de Salud.

Por las ventajas que ofrece esta tecnología, se pretenden sustituir paulatinamente las técnicas actuales UMELISA de la tecnología SUMA, por la de microarreglos, la cual permite obtener un gran ahorro de reactivos, sustituyendo el volumen de 30 µL empleado para cada determinación por solo 1 nL, así como el ahorro de tiempo, sobre todo, en los pesquisajes masivos, en los que a una muestra del mismo paciente se le podrán realizar varias determinaciones de una sola vez.

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