Obtención de conjugados 17 α- Hidroxiprogesterona/ Fosfatasa Alcalina para su empleo en el diagnóstico de Hiperplasia adrenal Congénita.

Resumen

La 17 α-Hidroxiprogesterona es el principal marcador bioquímico para la detección de la deficiencia de 21-hidroxilasa, responsable del 95 % de los casos de Hiperplasia Adrenal Congénita (HAC). Se prepararon conjugados 17 α-Hidroxiprogesterona –Fosfatasa Alcalina (FA), para su empleo en un ensayo destinado a la medición de esta hormona. La conjugación se realizó con la variante de la hormona derivatizada, 17α-Hidroxiprogesterona 3- (O-Carboximetil) Oxima (17OHP3OCMO), mediante el método de la carbodiimida, empleando N,N’ -diisopropil carbodiimida (EDC). Se evaluaron los siguientes parámetros para establecer las condiciones óptimas de conjugación: solución reguladora, relación molar, concentración final de EDC, volumen final del medio de reacción, composición y pH de la mezcla de reacción y temperatura. Se evaluó su funcionamiento en un ensayo UMELISA con placas recubiertas con anticuerpos policlonales anti 17 α-Hidroxiprogesterona, usando una curva de calibración de la hormona en sangre seca sobre papel de filtro (rango útil de 15. 6 – 250 nmol/L) y el sustrato fluorescente 4- metilumbeliferilfosfato. Los mejores resultados se alcanzaron con: PBS 0.05 mol/L pH 7.5 como solución reguladora, relación molar FA- 17OHP3OCMO 1:4 (4.5 mg – 50 μg), concentración final de EDC 0.1 mol/L, volumen final de 1 mL con una fase acuosa predominante compuesta por PBS y temperatura de 4º C. El estudio de estabilidad mostró que el conjugado es estable al menos 17 meses. Se obtuvo un conjugado con un título de 1:5000 apropiado para ser usado en un ensayo para la medición de 17 α-Hidroxiprogesterona.