Electroforesis bidimensional de campos pulsados en minicámaras para caracterizar los cromosomas de Cryptococcus neoformans: procedimiento bioinformático

Resumen

Cryptococcus neoformans es una levadura que provoca meningoencefalitis comúnmente en pacientes inmunodeprimidos. El incremento en su incidencia ha motivado estudios epidemiológicos de aislados clínicos para establecer redes de vigilancia. La electroforesis de campos pulsados (ECP) es una de las técnicas más utilizadas en la subtipación molecular de microorganismos con fines epidemiológicos, por su versatilidad y reproducibilidad; sin embargo, el análisis del genoma de eucariotas mediante un único experimento de ECP solo revela aquellas mutaciones que modifican el tamaño de sus cromosomas. El presente trabajo propone una metodología para caracterizar el genoma de C. neoformans mediante ECP bidimensional y describe el procedimiento bioinformático que permitió el diseño y la comprobación in silico de la utilidad de dicha metodología. La separación de los cromosomas intactos de las cepas estudiadas en la primera dimensión (1D) se logra en 9.3 h de ECP en una cámara miniCHEF, aplicando tiempos de pulso (tp) entre 30 y 90 s. La huella digital cromosomal se obtuvo en la segunda dimensión (2D) después de la restricción de las bandas obtenidas en 1D con Not I o Sfi I y la separación de los fragmentos en la cámara miniCHEF, aplicando tp entre 1 y 15 s durante 5 h. Esta metodología evidencia las diferencias genéticas entre cepas de C. neoformans invisibles en la 1D, luego de 14,3 h de electroforesis (1D + 2D), en contraste con las 30 a 40 h que tomaría una ECP en cámaras CHEF convencionales. Esta metodología pudiera implementarse para el estudio del genoma de otras especies de eucariotas unicelulares.