Identificación de cultivares comerciales de caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido) mediante el empleo de isoenzimas peroxidasas

Número: 
Autores/Authors: 
Ana C. Arellano Litardo, Miguel Ramos Leal, Zaida Loor Márquez, Leyddi Cabanilla Guamán, Sofía Borisovna Korneva, Astolfo Pincay Flores
Palabras Claves / Key words: 
isoenzimas peroxidasas, caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido), somaclones, micropropagación, peroxidase isozyme, sugarcane (Saccharum spp. hybrid), somaclones, micropropagation
Resumen: 
La explotación de la caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido) con fines comerciales ha provocado una gran demanda de diversos cultivares con variadas propiedades de rendimiento industrial, azucarero y resistencia a plagas y enfermedades. La identificación de dichos cultivares depende en muchas ocasiones de la experiencia de especialistas familiarizados con los caracteres morfológicos más importantes que distinguen a esta especie. El advenimiento de los marcadores genéticos (heredables) ha dado un vuelco en algunos de estos métodos de identificación. Se identificaron 14 cultivares de la caña de azúcar, basado en el análisis mediante el método de patrones de isoenzimas peroxidasas. El método se inició con extractos crudos de proteínas a partir del tejido foliar de la caña de azúcar. La corrida electroforética sobre un gel de poliacrilamida en condiciones nativas, permitió separar los diferentes patrones de bandas, característico de cada cultivar. El método, ampliamente descrito, ofrece la posibilidad de ser aplicado para la rápida identificación de cultivares comerciales de caña de azúcar, lo que facilita la eliminación de las mezclas de estos, que puede causar disminución en los rendimientos. Su empleo también permitió confirmar la estabilidad genética de plantas micropropagadas y encontrar ligeras diferencias en somaclones obtenidos por cultivo de tejidos, aunque para este último objetivo el método resulta insuficiente
Abstract: 
Exploitation of sugarcane (Saccharum spp. hybrid) with commercial purposes have provoqued a great demand of diverse cultivars with different traits of industrial and sugar yield, resistance to pests and diseases, etc. Identification of those cultivars depend on the experience of experts familiar with the most important morphological features which distinguish this specie. Advenment of heritable genetic markers has provided a jump in some of these methods of identification. Fourteen sugarcane commercial cultivars were identified based on the biochemical analysis of peroxidase isozyme patterns. Sugarcane leaves were macerated in a buffer containing sucrose for the isolation of protein crude extract. The crude extract from foliar tissue was applied on a polyacrylamide gel electrophoresis in native conditions. Proteins were separated in their different sizes, due to the molecular sieving produced by the gel concentration. Results showed the formation of band patterns which characterize each cultivar. The method widely described, offers the rapid identification of sugarcane commercial cultivars, allowing the elimination of mix cultivars, which cause a yield decrement. Confirmation of genetic stability of micropropagated plants and the finding of slight differences among somaclones and donor plants were also demonstrated, but in this last aim peroxidase isozyme is not sufficient
Texto Completo: 

INTRODUCCIÓN

La caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido), perteneciente a la tribu Andropogonae posee un elevado número de cultivares comerciales que son híbridos interespecíficos de gran complejidad genética.1 Como arquetipo de las plantas C-4, la caña de azúcar convierte con más eficiencia la energía solar en energía metabólicamente utilizable a través de la fotosíntesis. La producción de azúcar y la conversión de muchos de sus derivados, son los principales referentes en este cultivo.2

La aplicación de métodos biotecnológicos en las plantas abre múltiples posibilidades de trabajo en los esquemas de mejoramiento y selección. Lograr un elevado número de plantas idénticas al donante y libre de enfermedades mediante la micropropagación masiva de meristemos o micromeristemos, la obtención de nuevas variedades mediante la explotación de la llamada “variación somaclonal”,3 son ejemplos de estas aplicaciones. Todo lo anterior implica la necesidad de contar con métodos que garanticen la identificación genética del material biológico inicial y del obtenido.

Por otro lado, la existencia de mezclas varietales es uno de los factores que influyen negativamente en el rendimiento agrícola de cualquier cultivo, incluida la caña de azúcar. Los marcadores genéticos son caracteres heredables que usualmente están asociados a  caracteres de importancia económica. Las isoenzimas son un marcador bioquímico que constituye una herramienta útil para obtener información acerca de la identidad de las especies vegetales. La electroforesis de isoenzimas permite revelar el polimorfismo bioquímico mediante patrones de bandas que corresponden a fenotipos electroforéticos derivados de la constitución genética de las plantas.4 Las isoenzimas peroxidasas (E.C. 1.11.1.7) desempeñan un importante papel fisiológico en prácticamente todos los cultivos. La actividad peroxidasa se ha asociado a múltiples eventos, en particular, a la edad de las plantas y otros factores externos, como cambios drásticos de temperatura, humedad,  sequía, etc.

Diferentes trabajos realizados con anterioridad han mostrado que  los patrones de isoenzimas peroxidasas son capaces de diferenciar inequívocamente variedades comerciales de caña de azúcar.5-7

En tal sentido, el Centro de Investigación y Desarrollo de la Unión Nacional de Cañicultores del Ecuador (UNCE) se trazó como objetivos la identificación de cultivares comerciales de caña de azúcar, mediante la técnica de electroforesis de las isoenzimas peroxidasas, así como la determinación de la homogeneidad genética de plantas micropropagadas y el posible hallazgo de diferencias en somaclones obtenidos mediante cultivo de callos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron plantas adultas de un grupo de 14 cultivares comerciales de caña de azúcar de más de seis meses de edad (Tabla 1). Se seleccionaron las hojas +3 según la clasificación de Kuijper.8 Un gramo de las hojas se maceró con el empleo de nitrógeno líquido en un mortero preenfriado al que se añadió una disolución que contenía sacarosa 20 y 0,025 % dietilditiocarbamato de sodio (DECA).

Similar procedimiento se utilizó con varias decenas de plantas micropropagadas, llevadas a campo con aproximadamente tres meses de aclimatación a condiciones controladas. En el caso de los somaclones, los callos se obtuvieron de las hojas primordiales, que se sembraron en el medio H1 (MS modificado + 1 mg de 2,4-D) y propagados hasta el sexto pase.9 Estos somaclones obtenidos a partir de los callos de los dos cultivares comerciales más extendidos en el Ecuador (Ragnar y CC85-92), se seleccionaron y se evaluó un grupo de estos individuos que han sido seleccionados durante más de cinco años y están considerados como los primeros somaclones élites dentro de la selección. 

Tabla 1. Cultivares de caña de azúcar empleados para el análisis de identificación varietal.

Técnica electroforética

La electroforesis se realizó con el empleo de un sistema de corrida en lámina vertical.6 El gel de separación de poliacrilamida empleado fue de 8.5 %, con una disolución reguladora de corrida de Tris-Glicina  0,04 mol . L-1 a pH 8,3. Se aplicaron 40 m/L de muestra y se utilizó una intensidad de corriente de 50 mA durante 6 h. El método de tinción se basó en el empleo de o-dianisidina, según lo informado previamente.10 Estos ensayos se realizaron al menos durante cinco repeticiones.

Análisis estadístico

Se analizaron las bandas consistentes y reproducibles de los patrones de peroxidasas de los cultivares, según el criterio de presencia (1) o ausencia (0). Esta matriz binaria se usó para construir una matriz de similitud entre los pares de cultivares de caña de azúcar, según el índice de similitud genética de Jaccard mediante el paquete de programas PAST V. 2.15.11 Para realizar el análisis, se empleó el método de agrupamiento UPGMA, basado en el análisis de la media aritmética de pares agrupados no ponderados, basado en la matriz de similitud, para producir el dendrograma de genotipos. Para confirmar el agrupamiento obtenido, se efectúo un remuestreo UPGMA para el análisis de los datos binarios. El coeficiente de Jaccard se calculó como

 donde:

 

 

A número de bandas únicas del primer genotipo.

B número de bandas únicas del segundo genotipo.

C número de bandas comunes compartidas por los genotipos A y B.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados permitieron distinguir los patrones de las isoenzimas peroxidasas, que resultaron completamente diferenciales para cada uno de los cultivares empleados (Figura 1). Se encontraron 12 bandas, lo que confirma que este marcador bioquímico es marcadamente polimórfico para este cultivo, lo que favorece su utilización como criterio de identificación. Puede apreciarse que el cultivar Ragnar que aparece en los carriles 2, 6 y 7, presenta patrones similares en todos los casos.

La mayor cantidad de bandas para todos los patrones aparecieron distribuidas en la región anódica. Sin embargo, aunque en menor número, las existentes en la región catódica resultaron efectivas también como marcadores varietales. Es notable que con algunas de las muestras analizadas no se ofrezcan todos sus detalles en la nomenclatura, por desconocimiento en la exactitud de su denominación. Esta situación todavía es frecuente en muchas de las regiones donde se cultiva extensivamente la caña de azúcar en el Ecuador.

Fig. 1. Patrones de isoenzimas Peroxidasas de cultivares de caña de azúcar en explotación comercial en el Ecuador. Carriles 2: Ragnar; 3: Cali-Colombia; 4: C87-51; 5: Mex64-1487; 6: Ragnar; 7: Ragnar; 8: CC85-92; 9: CC95-¿?; 10: CR74-??; 11: CR74-250; 12: RD75-??; 13: RD75-11; 14: PR??; 15: Esmeraldas; 16: BJ70-??; 17: BJ70-46; 18: SP70-1143; 19: CP??; 20: PCG127-4.

En casos como estos, la posibilidad de contar con un amplio banco de germoplasma que contenga un número importante de individuos bien identificados, facilitaría la comparación por la probable existencia de la variedad. Ello posibilitaría el análisis comparativo con los cultivares más probables y la posterior determinación del cultivar en cuestión. Como continuación de este proyecto de investigación, se inició la creación de un banco de germoplasma que permitirá acceder a los principales cultivares en explotación en el país y dar un criterio más aclaratorio sobre estas variedades dudosas. A la vez, permitirá proveer de genotipos bien identificados y de elevada calidad genética y fitosanitaria.

El índice de similitud genética entre los 14 genotipos estudiados se llevó a cabo mediante el coeficiente de Jaccard a partir de la matriz binaria basada en presencia – ausencia de las bandas (Tabla 2), debido a que este índice presentó el mayor valor del coeficiente de correlación cofenético (indicador del nivel de agrupamiento para cada fusión y que es proporcional a la distancia de agrupamiento).  El análisis indicó que los agrupamientos eran de baja robustez, con excepción del que mostró un valor de remuestreo de 64, que lo hace de nivel moderado (Figura 2).  Este caso se puede entender si se considera que ambos cultivares (CC85-92 y CC95–¿?) provienen de los progenitores más empleados en las campañas de cruzamiento colombiano. El resultado general indicó que existe una diversidad genética bastante elevada entre los diferentes cultivares estudiados.

Aunque para el análisis visual de identificación de los cultivares de caña de azúcar basado en los patrones de las isoenzimas peroxidasas este análisis genético no es imprescindible, este resultado apoya lo obtenido sobre las diferencias entre los diferentes cultivares.

Tabla 2. Matriz binaria de datos de los patrones de las isoenzimas peroxidasas de los principales cultivares de caña de azúcar. C) Bandas catiónicas A) Bandas aniónicas.

Este trabajo permitió precisar para el caso del Ecuador que los cultivares CC85-92 y las llamadas Cali-Colombia y CC95-?? (carriles 8, 3 y 9) aunque provienen del mismo centro de mejoramiento (Cenicaña Calí, Colombia), son cultivares diferentes.

Fig. 2. Análisis de agrupamiento basado en los patrones de isoenzimas peroxidasas de los cultivares comerciales de caña de azúcar. Los números en los clados representan el valor de remuestreo.

Numerosos autores han usado la electroforesis de isoenzimas para la identificación taxonómica de diferentes cultivos.11-13 Para la caña de azúcar, este elevado polimorfismo había sido observado por Thom y Maretzki,5 luego por Ruiz et al.6 y más recientemente, por Schugurensky y Díaz7 y permitió determinar diferencias que identifican variedades comerciales. Este trabajo ha permitido el establecimiento de los patrones isoenzimáticos para la peroxidasa, que permiten la identificación de las distintas variedades de caña de azúcar en el Ecuador.6  

El análisis de las plantas micropropagadas empleando este mismo sistema isoenzimático de peroxidasa permitió también corroborar la ausencia de diferencias entre dichas plantas y su donante (Fig. 3). Tal y como ha sido establecido, el proceso de micropropagación con el empleo de meristemos, permite obtener grandes poblaciones de plantas idénticas a la original, con la ventaja de su rejuvenecimiento y la eliminación de algunas enfermedades de carácter sistémico (bacterianas y virales) que se mueven a través del floema. Autores como González-Paneque et al.14 y Silva15 emplearon sistemas isoenzimáticos para confirmar la estabilidad genética de poblaciones micropropagadas de diferentes cultivos.

Fig. 3. Patrones de isoenzimas peroxidasas de plantas micropropagadas del cultivar comercial de caña de azúcar CC85-92.

En relación con los somaclones obtenidos mediante la explotación de la variación somaclonal, los resultados permitieron determinar la presencia de algunas diferencias en los patrones de peroxidasas (Figura 4). Fue posible observar algunas diferencias al comparar las variedades donantes con los somaclones obtenidos y que se encontraban en etapa de “lotes replicados”. Pudieron apreciarse diferencias en las bandas 2, 3 y 4  en varios de los individuos. Otras diferencias se apreciaron en la banda 6, ubicada a continuación de la banda mayoritaria 5.

Sin embargo, esta variabilidad puede considerarse baja, por el escaso número de variaciones detectadas, no por la que realmente se introduce por la variación somaclonal e independiente también del tamaño de la muestra. Estos resultados coincidieron con trabajos anteriores,6,16 en los que se lograron detectar diferencias en somaclones de caña de azúcar con elevado rendimiento azucarero.16 En el caso de los somaclones obtenidos a partir del cultivar CC85-92, fue difícil detectar diferencias entre dichos nuevos individuos y el cultivar donante.

Fig. 4. La figura muestra a la variedad donante Ragnar y ocho somaclones seleccionados. Patrones de isoenzimas peroxidasas de somaclones obtenidos por cultivo de callos del cultivar comercial de caña de azúcar. 1) Ragnar. 2-18) Somaclones élites de Ragnar.

La selección de estos nuevos somaclones ha constituido un largo proceso, que abarca más de cinco años, en el que la presión de selección sobre estos somaclones ha sido un aspecto crucial. Otros resultados relacionados con este aspecto han sido publicados en otro trabajo, en el que se detalla el comportamiento en condiciones de campo.17 Si se tiene en cuenta que los somaclones no se corresponden con una recombinación genética como en el caso de un cruce sexual, sino reorganizaciones en algunas características genotípicas, se comprenderá que su genofondo es, en principio muy semejante al del cultivar que le dió origen. Esto hace difícil la observación de cambios entre ambos genotipos. Sin embargo, es necesario señalar que aunque estas diferencias han sido observadas, el método parece ser insuficiente para estos fines.

Resultados previos obtenidos en caña de azúcar, mostraron que el empleo de otros sistemas isoenzimáticos como esterasas y malato-deshidrogenasas aportaron poco polimorfismo, lo cual hace aún más difícil la detección de cambios genéticos.6 La detección de variantes somaclonales como alternativa al mejoramiento tradicional continúa en estudio, por la posibilidad de incorporar nuevos genotipos con nuevas características deseables.18 Varios cultivos de interés económico como la papa,19,20Hevea brasiliensis,21Populus sp.,22 y palma aceitera,23 han sido sometidos a procesos de mejora a través de la variación somaclonal y en algunos casos, a través de la aplicación de métodos moleculares para su detección. Todo esto a pesar que muchos de los mecanismos de la variación somaclonal son aún poco conocidos.24

Para el caso de la caña de azúcar, desde la descripción inicial del proceso3 hasta trabajos más actuales, la variación somaclonal es empleada como alternativa al mejoramiento tradicional y su detección descansa en el empleo de marcadores genéticos.25-27  

La electroforesis de isoenzimas peroxidasas es un método simple y de costo relativamente bajo, que es capaz de diferenciar cultivares de caña de azúcar mediante  patrones de bandas. La incorporación de métodos moleculares más potentes, basados en el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa, permite la diferenciación entre estos nuevos individuos y sus cultivares donantes. Trabajos posteriores confirmarán, desde el punto de vista genético,  la existencia de estas nuevas variantes somaclonales de caña de azúcar, que presentan patrones de amplificación basados en secuencias inversas repetidas (ISTR) según lo descrito por Rhode.28

La electroforesis de isoenzimas a pesar de la aparición de nuevas y más potentes técnicas genéticas, sigue siendo un método muy empleada en diferentes especies vegetales, como en el estudio de progenitores de las especies forrajeras Stylosanthes scabra y S. viscosa para determinar alotetraploides tolerantes al estrés hídrico.29

CONCLUSIONES

El sistema de isoenzimas peroxidasas permite identificar los cultivares comerciales de caña de azúcar a partir de sus patrones de bandas y muestra un elevado nivel de polimorfismo bioquímico para este cultivo y un bajo índice de similitud genética entre los cultivares.

El patrón de peroxidasas permitió confirmar la homogeneidad genética existente entre las plantas micropropagadas y su donante, para los dos cultivares estudiados.

El patrón de isoenzimas peroxidasas no es el método más indicado para diferenciar genotipos obtenidos por variación somaclonal. A pesar de detectarse diferencias, el sistema resulta insuficiente.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer a la Asistencia Oficial para el Desarrollo de Japón y al Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca por el financiamiento mediante el Proyecto 2KR; también a la Unión Nacional de Cañicultores del Ecuador (UNCE), por el apoyo financiero y las facilidades para el desarrollo de este trabajo. Agradecemos igualmente al Ing. Rodolfo Samaniego y a Jorge Franco por su ayuda invaluable en diferentes etapas del trabajo. MRL agradece al acuerdo de colaboración ‘’Biotecnología de la caña de azúcar y empleo de residuos de la agro-industria azucarera’’, entre el Laboratorio de Biotecnología del Dpto. Microbiología y Virología de la Facultad de Biología de la Universidad de La Habana, la UNCE y la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil, Ecuador, que ha permitido realizar parte de este trabajo. Al Dr. Orlando Coto quien facilitó los análisis estadísticos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Pérez G, Bernal N, Chinea A, O`Really J, De Prada F. Recursos genéticos de la caña de azúcar. Cuba: Publicaciones Imago; 1997: Cap. 3, p. 10

2. Pincay A. El calentamiento global. El Bananero 2007; 34:14-19.

3. Larkin P, Scowcroft P. Somaclonal variation: a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor Appl Genet. 1981; 60:197-214.

4. Arias MC, Díaz D. Instituto de Genética Ewald Favret, CICV y A, Edit. Inst. Nac. Tecnología Agropecuaria (INTA), Cantelar, Argentina

5. Thom M, Maretzki A. Peroxidase and esterase isozymes in Hawaiian sugarcane. Hawaii Plant Rep. 1970; 58(6):81-94.

6. Ruiz A, Maribona RH, Korneva S, Ramos-Leal M, Izquierdo F, Héctor E. Biochemical markers for sugarcane selection. Proc. 19 ISSCT Congress (Physiol.). Indonesia, 1986; 1:273-283.

7. Schugurensky A, Díaz L. Identificación de clones micropropagados de caña de azúcar (Saccharum sp.) por electroforesis de isoenzimas. Revista Fac. Agron. (LUZ) Venezuela: 2001; 18:169-175.

8. Van Dillewijn C. Botánica de la caña de azúcar. Edic. Revolucionaria 2da. Ed. Instituto Cubano del Libro, La Habana. 1970 Cap 5.

9. Díaz E, Korneva SB, Maribona RH, Ancheta O. Morfogénesis de suspensiones celulares de caña de azúcar. Biotecnol. Aplic. 1991; 8(1):53-62.

10. Iglesias L, Lima H, Simón JP. Isozyme identification of cigotic and nucellar seedling in Citrus. J. Hered. 1974; 65: 81-84.

11. Hammer O, Harper DAT, Ryan PD. PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Paleontología Electrónica 2001; 4(1): 1-9

12. Figueroa MI, Schugurensky A. Identificación isoenzimática de portainjertos de palto (Persea americana Mill.) Agrosur 2002; 30(2): 1-6. ISSN 0304-8802.

13. González C, Román MI, Xiqués X, Dueñas J, Jiménez R, Rodríguez NN. Caracterización isoenzimática de cultivares de aguacate (Persea americana Mill.) en Cuba. Biología 2002; 16(1):20-26.

14. González- Paneque O, Valdés M, González C, Román MI, Xiqués X, Hernández MM, et al. Empleo de marcadores bioquímicos (isoenzimas) en la detección de la variabilidad genética en Ipomoea. Cultivos Tropicales 2008; 29: 11-16.

15. Silva JJ. Micropropagación del cacao. Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas. La Habana, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas. mes; 2006.

16. Maribona RH, Korneva S, Coto O, Díaz P, Ruiz A, Oliva O, et al. Obtención de somaclones de caña de azúcar de alto rendimiento agrícola mediante el cultivo de tejidos. Ciencias Biológicas. 1993; 24:10-14.

17. Arellano AC., Ramos-Leal M., Korneva SB., Pilco J., Chávez G., Cabrera C, et al. Evaluación de la resistencia a la roya parda (Puccinia melanocephala Syd.) de somaclones de caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido) obtenidos en el Ecuador. Fitosanidad 2011; 15(4):245-250.

18. Sánchez-Chiang N, Jiménez VM. Técnicas moleculares para la detección de variantes somaclonales. Agronomía Mesoamericana 20(1): 135-151.

19. Ehsanpour AA, Madani S, Hoseini M. Detection of somaclonal variation in potato callus induced by UV-C radiation using RAPD-PCR.Gen Appl Plant Physiol.2007; 33 (1-2): 3-11.

20. Bordallo P. Somaclonal variation on in vitro callus culture potato cultivars.Hortic Bras. [en línea] 2004, 22(2): 300-304.

21. Medina C, García I, Caro M, Aristizábal FA. Análisis AFLP de variación somaclonal en embriones somáticos de Hevea brasiliensis. Revista Col Cienc QuímFarm. 2007; 36 (1):70-80.

22. Ostry ME, Ward KT. Field performance of Populus expressing somaclonal variation in resistance to Septoria musiva. Plant Science. 2003; 164:1-8.

23. Jaligot E, Rival A, Beulé T, Dussert S, Verdeil JL. Somaclonal variation in oil palm in vitro callus culture. Plant Cell Reports 2000; 19(7): 684-690.

24. Rodríguez- Enríquez J, Dickinson HG, Grant- Downton RT. MicroRNA misregulation: an verlooked factor generating somaclonal variation? Trends in Plant Science. 2011, 16 (5):242-248.

25. Shahid MTM, Khan FA, Saeed A, Aslam M, Rasul F. Development of somaclones in sugarcane genotype BF-162 and assessment of variability by random amplified polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeats (SSR) markers in selected red rot resistant somaclones. Afr J Biotechnology. 2012; 11(15):3502-3513.

26. Perera MF, García MG, Noguera AS, Sepúlveda M, Filippone MP, Castagnaro AP. Evaluación de la variación somaclonal en vitroplantas de caña de azúcar mediante marcadores moleculares. Rev Indust Agric. Tucumán. 2010; 87(2): 13-21.

27. Smiullah FA, Abdullah K, Afzal A, Aslam M, Zafar J, Iftikhar IR, et al. In vitro regeneration, detection of somaclonal variation and screening for mosaic virus in sugarcane (Saccharum spp.) somaclones. Afr J Biotechnology. 2012; 11(48): 10841-10850.

28. Rhode W. Inverse sequence tagged repeat (ISTR) analysis: a novel and universal PCR based-technique for genome analysis in the plant and animal Kingdom. J Genet & Breed. 1996; 20:249-261.

29. Tewari S, Chandra A. Genetical assessment of diploid progenitors of Stylosanthes scabra by isozymes, RAPD and STS markers: a possible strategy for improvement of drought tolerant allo-tetraploid S. scabra species. Euphytica 2008; 162:39-50.

 

 

pdf: