A thymidineless Escherichia coli strain useful for in vivo DNA labeling

Resumen

Los métodos de detección no radiactivos eliminan las desventajas
que representa el uso de la radioactividad en el diagnóstico médico. Tanto el
ADN plasmídico como el cromosomal han sido marcados in vivo con el empleo
de la 5-fluordesoxiuridina (FdUrd) como inhibidor de la timidilato sintasa (mé-
todo FdUrd). Con el objetivo de evitar el empleo de FdUrd fue obtenida una
cepa de Escherichia coli auxótrofa para la timidina (thy-). Dicha cepa fue utilizada
para el marcaje in vivo con BrdUrd de ADN plasmídico (método thy-). La
cepa de E. coli, DH5a fue mutagenizada con N-metil-N-nitro-Nnitrosoguanidina.
Se seleccionó una colonia mediante crecimiento selectivo en medio
mínimo y medio mínimo con suplemento de timidina (0,6 g/L). La cepa mostró
un índice de reversión menor que 3,93 · 10-8 en medio mínimo con suplemento.
Se realizó un estudio comparativo in vivo de estos sistemas de marcaje. La detecci
ón del ADN simple y doble cadena marcado con BrdUrd se llevó a cabo
inmunoenzimáticamente. El valor límite de detección fue de 1 ng para el ADN
simple cadena marcado por el método thy- y de 5 ng para el marcado por el
método FdUrd. El valor de detección límite está relacionado con la cantidad de
ADN, simple o doble cadena, disponible para la detección por anticuerpo anti-5-
BrdUrd. La sensibilidad del sistema es comparable a la de otros sistemas no
radioactivos de marcaje de ADN. Estos resultados demuestran la capacidad de
la cepa thy- para el marcaje in vivo de ADN como un sistema capaz de producir
grandes cantidades de sonda marcada.